協同生物(wù)
譯者導讀：這(zhè)是一篇關于構建小鼠膽結石疾病模型以研究人(rén)類膽結石形成機制的(de)文章(zhāng)，該文論述了(le)小鼠膽結石模型建立的(de)研究曆程，指出了(le)人(rén)類膽結石形成機制的(de)新思路。
重點是，文章(zhāng)總結了(le)諸多(duō)研究的(de)過程與結果，這(zhè)些研究通(tōng)過結合基因組學方法和(hé)小鼠表型研究成功鑒定了(le)Lith基因，爲人(rén)類Lith基因的(de)發現推平道路。用(yòng)基因敲除或轉基因方法爲膽結石這(zhè)種“古老而又新鮮”的(de)肝膽疾病的(de)病理(lǐ)生理(lǐ)學研究提供了(le)新的(de)視角。對(duì)于從事膽結石課題研究、動物(wù)模型建立、高(gāo)膽固醇飼料制備等工作的(de)研究者來(lái)說，此文值得(de)一讀。
作者：Tony Y. Wang、Piero Portincasa等
譯者：協同生物(wù)蘇永騰博士
前言
膽結石是最常見的(de)肝膽疾病之一，12%美(měi)國成年人(rén)深受其害，爲減少膽結石的(de)發病率、死亡率，深入研究膽結石的(de)病理(lǐ)生理(lǐ)學将有助于開發出創新有效的(de)治療方法。
從20世紀50年代開始，研究者就通(tōng)過給倉鼠、老鼠、豚鼠、兔子和(hé)猴子等實驗動物(wù)喂養數周到幾個(gè)月(yuè)的(de)高(gāo)膽固醇飼料并成功建立了(le)膽結石模型，從而根據模型研究膽結石疾病的(de)發病機制。直至上世紀90年代，第一個(gè)與膽結石相關的(de)基因-Lith1在近交系C57L/J小鼠中得(de)以鑒定。
我們通(tōng)過此文介紹小鼠膽結石模型的(de)建立、模型對(duì)遺傳研究以及膽結石病理(lǐ)生理(lǐ)學研究的(de)貢獻，爲膽結石研究做(zuò)一個(gè)概覽綜述。
小鼠膽結石模型的(de)建立
Tepperman等研究者率先發現可(kě)以通(tōng)過膽固醇和(hé)膽酸的(de)組合使用(yòng)來(lái)建立小鼠膽結石模型。在喂養含有膽固醇和(hé)膽酸的(de)飼料後，發現從小鼠膽石中提取出來(lái)的(de)甾醇基本上是膽固醇，占了(le)結石總重量的(de)94%，而單獨喂養1%膽固醇飼料2-8個(gè)月(yuè)卻不能誘發出膽結石。由此可(kě)見，膽酸在小鼠膽結石模型建立中必不可(kě)少。
1978年，Fujihira等研究者給七種近交系小鼠飼喂高(gāo)膽固醇飼料8周後觀察到小鼠出現膽結石，患病率從0%到100%不等。Alexander和(hé)Portman等人(rén)的(de)研究進一步确認了(le)小鼠在高(gāo)膽固醇飼料的(de)喂養下(xià)，膽結石患病率存在品系差異，這(zhè)些研究分(fēn)析爲小鼠膽結石病基因研究打下(xià)了(le)良好基礎。
更重要的(de)是，Wang等人(rén)發現小鼠喂養高(gāo)膽固醇飼料8周内膽固醇結晶和(hé)膽結石形成的(de)具體過程，先是粘蛋白凝膠的(de)初始積累，繼而出現無水(shuǐ)或液晶狀外觀，然後這(zhè)些膽固醇晶體聚集，最後出現砂質結石和(hé)真膽結石（見下(xià)圖）。
膽結石易感小鼠C57L/J飼喂高(gāo)膽固醇飼料8周内膽固醇結晶和(hé)膽結石形成的(de)顯微照(zhào)片（用(yòng)相襯法，偏光(guāng)顯微鏡）
（a）粘蛋白凝膠；（b）小液晶；（c）聚集液晶；（d）具有麥芽交叉雙折射和(hé)焦點圓錐結構的(de)熔融液晶；（e）弧形（可(kě)能是無水(shuǐ)膽固醇）晶體；（f）絲狀晶體；（g）端部管狀晶體破裂産生膽固醇一水(shuǐ)合物(wù)晶體；（h）典型的(de)膽固醇一水(shuǐ)合物(wù)晶體，從28和(hé)100.88的(de)角度；（i）聚集的(de)膽固醇一水(shuǐ)合物(wù)晶體；（j和(hé)k）砂質結石；（l）膽結石。
小鼠模型對(duì)膽結石遺傳學研究的(de)貢獻
流行病學和(hé)臨床調查（如對(duì)不同家庭和(hé)雙胞胎的(de)相關調查）研究已很清楚地表明(míng)了(le)遺傳基礎在個(gè)體患膽結石病方面發揮了(le)關鍵性的(de)作用(yòng)。然而，人(rén)們還(hái)沒有全部掌握遺傳因素對(duì)膽結石的(de)影(yǐng)響，因爲膽結石是由多(duō)種環境因素以及未知基因相互作用(yòng)和(hé)複雜(zá)調控引起的(de)。
此外，爲了(le)定量研究多(duō)基因性狀，常規單基因性狀遺傳作圖法不适用(yòng)于膽結石研究。近交系老鼠有著(zhe)優良的(de)遺傳資源，是研究膽結石遺傳學的(de)優選動物(wù)模型。Khanuja等人(rén)在給實驗小鼠飼喂高(gāo)膽固醇飼料12周後，率先發現了(le)膽結石易感鼠C57L/J和(hé)抗膽結石鼠AKR/J之間成石的(de)差異是由兩個(gè)Lith基因決定——Lith1和(hé)Lith2.
随後，C57L/J和(hé)AKR/J小鼠的(de)肝、膽囊、小腸等部位都被用(yòng)來(lái)進行了(le)系統的(de)基因表型對(duì)比研究。爲了(le)判斷Lith1和(hé)Lith2兩個(gè)基因中哪個(gè)單獨誘導膽結石的(de)産生，攜帶Lith1的(de)C57L/J小鼠（膽結石易感）或Lith2等位基因的(de)AKR/J小鼠（抗膽結石）模型被建立并進行緻石研究，結果發現Lith1和(hé)Lith2通(tōng)過不同的(de)成石機制誘導膽結石的(de)發生，Lith1調控膽固醇的(de)代謝，Lith2則與膽汁酸分(fēn)泌密切相關。
研究者通(tōng)過更多(duō)的(de)近交系小鼠膽結石模型研究發現，還(hái)有更多(duō)Lith基因參與膽結石的(de)成石調控，Lith基因家族Lith1～Lith25在染色體上的(de)分(fēn)布如下(xià)圖所示。
膽結石（Lith）基因圖譜
一條垂直線代表一條染色體，著(zhe)絲粒在頂端。距著(zhe)絲粒（水(shuǐ)平黑(hēi)線）的(de)遺傳距離顯示在染色體的(de)左側。膽結石QTL（Lith基因）和(hé)候選基因的(de)位置用(yòng)水(shuǐ)平黑(hēi)線表示，基因符号在右邊（基因符号和(hé)名稱略）。
因爲人(rén)類和(hé)小鼠染色體同源的(de)原因，以上這(zhè)些來(lái)自小鼠的(de)基因研究對(duì)人(rén)類的(de)Lith基因的(de)發現有著(zhe)指導性的(de)作用(yòng)，并成功證實了(le)人(rén)類的(de)LITH基因ABCG5/G8。
研究者先是在小鼠身上發現和(hé)鑒定了(le)ABCG5/G8基因，随後在德國人(rén)和(hé)智利人(rén)身上發現ABCG5/G8的(de)兩個(gè)相關變體（即ABCG5-R50C和(hé)ABCG8-D19H），之後又在中國人(rén)和(hé)印度人(rén)身上得(de)以印證。
因此，根據小鼠的(de)Lith基因圖譜，人(rén)類的(de)更多(duō)Lith基因及其緻病性機制将得(de)以發現和(hé)闡明(míng)。2010年，研究者首次提出了(le)膽結石病的(de)五種發病因素（見下(xià)圖）：遺傳因素和(hé)Lith基因；肝膽固醇高(gāo)分(fēn)泌，導緻膽固醇過飽（即高(gāo)膽固醇飽和(hé)指數）；膽固醇結晶和(hé)固體膽固醇晶體的(de)生長(cháng)；膽囊運動受損；腸道因素，包括吸收的(de)膽固醇從小腸輸送到肝髒引起膽汁高(gāo)分(fēn)泌，以及腸道微生物(wù)群的(de)變化(huà)。
五種因素的(de)相互作用(yòng)示意圖：（i）遺傳因素和(hé)Lith基因；（ii）肝髒高(gāo)分(fēn)泌；（iii）膽囊動力低下(xià)；（iv）快(kuài)速相變以及（v）腸道因素。持續性肝膽固醇高(gāo)分(fēn)泌是遺傳因素調控的(de)結果，導緻膽固醇過飽和(hé)膽汁的(de)形成，加速膽固醇結晶。膽囊運動功能受損可(kě)導緻多(duō)餘粘蛋白凝膠的(de)産生和(hé)積累，促進膽泥的(de)形成和(hé)微小結石的(de)生長(cháng)。這(zhè)些改變也(yě)破壞了(le)膽汁酸（腸道因素）的(de)肝腸循環動力學，導緻腸道吸收和(hé)膽汁酸池的(de)變化(huà)。膽固醇吸收的(de)增加将過量膽固醇輸送到肝髒，分(fēn)泌到膽汁中。腸道微生物(wù)群的(de)異常可(kě)能會破壞肝髒、腸道和(hé)膽汁中膽固醇和(hé)膽汁酸的(de)代謝，并損害膽囊的(de)排空和(hé)再灌注。
可(kě)見，膽固醇晶體的(de)快(kuài)速生長(cháng)、聚集形成微小結石、最終成石這(zhè)一結果都是由于膽固醇過飽和(hé)導緻的(de)，還(hái)有就是膽囊粘液的(de)高(gāo)分(fēn)泌以及膽囊受損的(de)凝膠形成，最終導緻了(le)膽泥（即膽結石的(de)前體物(wù)）的(de)形成。
膽結石病理(lǐ)生理(lǐ)學研究最新進展
研究發現女(nǚ)性膽結石患病率明(míng)顯較高(gāo)于同年齡段的(de)男(nán)性，這(zhè)意味著(zhe)雌激素在膽結石的(de)發病機制中發揮了(le)關鍵性的(de)影(yǐng)響。盡管雌激素受體a（ERa）能通(tōng)過調控雌二醇（E2）的(de)形成來(lái)誘導雌性小鼠膽結石的(de)發生，但E2對(duì)小鼠的(de)緻石機理(lǐ)尚不明(míng)确。
一些研究發現，ERa基因敲除小鼠大(dà)劑量E2處理(lǐ)後仍發現膽結石。此外，有人(rén)發現名爲Lith18G的(de)一種膽結石基因同時(shí)也(yě)是一種雌激素受體——G蛋白偶聯受體30（GPR30）。這(zhè)一發現帶來(lái)了(le)一個(gè)新問題，E2是如何通(tōng)過有效綁定并激活GPR30和(hé)ERa來(lái)影(yǐng)響膽結石的(de)形成呢(ne)？
爲了(le)區(qū)分(fēn)ERa和(hé)GPR30的(de)緻石作用(yòng)，需要對(duì)整個(gè)膽固醇的(de)結晶路徑和(hé)順序去探究。通(tōng)過雌性野生型卵巢切除、GPR30敲除、ERa敲除和(hé)GPR30/ERa雙基因敲除等方法進行分(fēn)析研究。E2分(fēn)别與GPR30以及ERa結合後，激活了(le)液晶和(hé)無水(shuǐ)晶體的(de)産生，使得(de)膽汁從過飽和(hé)狀态進化(huà)到中間體結晶物(wù)。
此外，在GPR30/ERa-DKO小鼠模型中，膽固醇的(de)結晶明(míng)顯受阻。這(zhè)表明(míng)GPR30與ERa在促進E2誘導的(de)膽結石發生中具有協同作用(yòng)。由于GPR30主要存在于肝細胞的(de)内質網而不是細胞核内，其可(kě)能是通(tōng)過表皮生長(cháng)因子受體信号級聯途徑抑制肝髒膽固醇7a羟化(huà)酶和(hé)膽汁酸的(de)合成，導緻肝髒過量分(fēn)泌膽固醇并成石。
非酒精性脂肪肝（NAFLD）是膽結石形成的(de)一個(gè)重要影(yǐng)響因素，NAFLD與膽結石之間的(de)聯系機制仍不清楚。缺氧誘導因子1（HIF1）是調節氧傳遞、細胞生長(cháng)和(hé)氧化(huà)還(hái)原穩态相關基因表達的(de)重要轉錄因子，促進機體對(duì)缺氧環境的(de)适應性反應。
HIF1A主要存在于肝髒的(de)周圍靜脈，即生理(lǐ)性缺氧的(de)區(qū)域中。肝髒脂肪變性時(shí)，脂質的(de)積累使肝細胞的(de)體積明(míng)顯增大(dà)，循環減少而最終導緻缺氧。Asai等研究發現，在HIF1A基因敲除小鼠中，一種負責将肝髒分(fēn)泌液分(fēn)泌到膽管的(de)水(shuǐ)通(tōng)道蛋白-8（AQP-8）的(de)表達顯著增加。這(zhè)些變化(huà)使膽汁流量顯著增加35%，膽囊和(hé)肝髒膽汁中的(de)膽汁脂質濃度降低36%，并減輕了(le)膽囊的(de)炎症。
結果，肝髒特異性HIF1A基因敲除小鼠的(de)膽固醇結晶被抑制，膽結石的(de)形成也(yě)被阻止。相反，在飲食誘導的(de)肝脂肪變性中，由于HIF1A通(tōng)路的(de)激活，野生型小鼠肝髒加速了(le)膽結石的(de)形成。此外，在伴有膽結石的(de)NAFLD患者肝髒中HIF1A及其下(xià)遊靶點的(de)表達增加，這(zhè)種結果提示了(le)HIF1A在NAFLD患者的(de)膽結石中發揮了(le)重要影(yǐng)響。膽汁的(de)流動是由膽汁酸依賴性和(hé)非膽汁酸依賴性兩種途徑決定，水(shuǐ)和(hé)離子/非離子溶質通(tōng)過跨細胞和(hé)細胞旁途徑經肝細胞的(de)轉運促使了(le)膽汁的(de)形成。
Cludin 2（Cldn2）是一種細胞旁通(tōng)道形成蛋白，在肝細胞和(hé)膽管細胞中高(gāo)度表達。Matsumoto研究發現Cldn2基因敲除小鼠的(de)膽汁流速與野生型小鼠相比降低了(le)50%，這(zhè)是由于肝膽系統的(de)水(shuǐ)滲透性降低所緻，從而顯著增加膽汁中的(de)總脂質濃度。4周後，Cldn2基因敲除小鼠産生了(le)膽結石，而野生型小鼠并沒有出現結石，這(zhè)表明(míng)Cldn2對(duì)膽汁形成和(hé)膽汁脂質穩态至關重要。
有研究發現，在ABCG5和(hé)ABCG8兩種基因單獨缺失或都缺失的(de)小鼠肝髒中膽固醇分(fēn)泌顯著降低，但沒有完全消除，這(zhè)表明(míng)存在一種ABCG5/G8非依賴通(tōng)路可(kě)調節人(rén)體和(hé)小鼠的(de)膽汁膽固醇分(fēn)泌。
Wang等研究者指出，在成石狀态下(xià)，ABCG5/G8非依賴通(tōng)路膽固醇輸出占總量的(de)30%至40%，在高(gāo)膽固醇飲食中調節機體膽固醇分(fēn)泌上起著(zhe)關鍵作用(yòng)。在ABCG5/G8缺失的(de)情況下(xià)，這(zhè)種途徑參與了(le)膽固醇的(de)分(fēn)泌和(hé)膽結石形成。與ABCG5/G8不同的(de)是，這(zhè)種通(tōng)路途徑并不是由LXR通(tōng)過其信号通(tōng)路激活的(de)。這(zhè)一發現表明(míng)了(le)ABCG5/G8依賴性和(hé)ABCG5/G8非依賴性通(tōng)路在肝髒膽固醇分(fēn)泌和(hé)膽囊結石形成中都發揮著(zhe)重要作用(yòng)。
臨床研究發現，腸道膽囊收縮素（CCK）的(de)分(fēn)泌和(hé)膽囊排空受高(gāo)脂飲食的(de)破壞，但腹腔疾病對(duì)膽結石形成的(de)影(yǐng)響目前很少有研究。Wang等人(rén)建立CCK缺乏小鼠模型來(lái)研究腹腔疾病對(duì)膽汁分(fēn)泌的(de)影(yǐng)響，發現CCK基因敲除後小鼠表現膽囊排空受損，小腸轉運時(shí)間減少，腸道膽固醇吸收增加，過量的(de)腸道源性膽固醇導緻膽汁高(gāo)分(fēn)泌，從而引起膽固醇結晶和(hé)膽石形成。此外，有研究發現強效CCK-1受體拮抗劑Devaxipide通(tōng)過損害小鼠膽囊排空功能，擾亂膽固醇代謝和(hé)增強腸道膽固醇吸收，增加了(le)膽結石形成的(de)風險。上述實驗爲研究腹腔疾病患者膽結石的(de)發病機制提供了(le)重要依據。
膽汁中可(kě)能同時(shí)含有促核因子和(hé)抗核因子，其含量的(de)不平衡可(kě)能導緻膽固醇快(kuài)速結晶從而形成結石，但這(zhè)一說法仍需要更多(duō)的(de)研究來(lái)證實。粘蛋白是第一個(gè)被發現的(de)促進膽固醇結晶成石的(de)蛋白分(fēn)子，還(hái)有許多(duō)其他(tā)蛋白也(yě)被認爲是影(yǐng)響膽汁中膽固醇結晶的(de)促核因子或抗核因子，但它們作用(yòng)機制仍不清楚。
Niemann Pick C2（NPC2）是一種可(kě)溶性溶酶體蛋白，通(tōng)過激活ABCG5/G8介導的(de)膽固醇轉運通(tōng)路來(lái)調節肝髒膽固醇分(fēn)泌，它促進轉基因小鼠（人(rén)NPC2基因）的(de)膽固醇結晶和(hé)膽石形成。相比而言，NPC2基因缺乏的(de)小鼠在高(gāo)膽固醇飼料飼喂2周後肝髒膽固醇分(fēn)泌和(hé)膽石率減少。上述結果表明(míng)，這(zhè)些膽汁蛋白可(kě)能通(tōng)過膽汁中的(de)液晶途徑來(lái)調節膽固醇的(de)結晶以導緻膽結石發生。
腸道膽固醇的(de)高(gāo)效率吸收和(hé)高(gāo)膽固醇飲食（西方飲食模式）是小鼠的(de)兩個(gè)緻石因素。深入研究發現，有很多(duō)因素都可(kě)以在腸道膽固醇吸收、運送緻肝髒并分(fēn)泌于膽汁中的(de)途徑上影(yǐng)響膽固醇的(de)結晶而導緻膽結石的(de)形成，如膽固醇酯化(huà)、腸細胞内脂質轉運、乳糜微粒的(de)聚集等。此外，腸道微生物(wù)群和(hé)免疫系統對(duì)膽結石形成也(yě)有重要的(de)影(yǐng)響，但仍待進一步深入研究。
因此，那些影(yǐng)響肝細胞轉運和(hé)膽汁分(fēn)泌膽固醇、磷脂和(hé)膽汁酸的(de)因素都可(kě)以通(tōng)過引起膽固醇高(gāo)分(fēn)泌和(hé)膽固醇過飽和(hé)膽汁來(lái)促進膽結石的(de)形成。一些受體，如liver X receptor (LXR)、farnesoid X receptor(FXR)、pregnane X receptor (PXR)、constitutive androstane receptor (CAR)、 ERa等可(kě)以通(tōng)過肝髒脂質代謝的(de)途徑來(lái)影(yǐng)響膽結石的(de)形成。還(hái)有，對(duì)肝髒胰島素受體的(de)破壞也(yě)能提高(gāo)小鼠膽結石的(de)發病率，這(zhè)種破壞可(kě)以降低膽固醇7a羟化(huà)酶的(de)活性并影(yǐng)響膽汁酸的(de)合成，但胰島素抵抗在膽結石形成中的(de)作用(yòng)機制也(yě)尚不明(míng)确。
結論
上述小鼠膽結石研究的(de)成果爲研究同源人(rén)類結石基因和(hé)探索人(rén)類膽石形成的(de)機制打開了(le)大(dà)門。在未來(lái)的(de)研究中，小鼠模型建立和(hé)膽結石研究和(hé)應聚焦于核受體、腸道微生物(wù)群、血脂、高(gāo)胰島素血症、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運動的(de)生活方式等方面對(duì)膽結石形成的(de)影(yǐng)響。這(zhè)些小鼠模型實驗将爲肝膽疾病的(de)治療提供新的(de)依據。
本文來(lái)源：Mouse Models Of Gallstone Disease；Tony Y. Wang/Piero Portincasa著
