協同生物(wù)
非酒精脂肪性肝炎（NASH）是一種無過量飲酒，以肝髒細胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉炎症爲主要臨床病理(lǐ)特征的(de)綜合征。它是非酒精脂肪性肝病（NAFLD）發展爲肝硬化(huà)和(hé)肝癌的(de)一個(gè)重要階段。據報道NAFLD在發達國家的(de)發病率表現爲成人(rén)30%、兒(ér)童13%，其中大(dà)約有10%的(de)NAFLD患者發展成爲NASH，而NASH患者中的(de)10%會發展成爲肝硬化(huà)，甚至肝癌。
非酒精脂肪性肝炎已經成爲研究的(de)焦點，然而NASH的(de)發病機制尚未明(míng)确，研究發現其與胰島素抵抗、氧化(huà)應激、瘦素、Kupffer細胞等多(duō)種因素相關。目前臨床上的(de)藥物(wù)普遍存在毒副作用(yòng)較大(dà)、價格昂貴等問題，而被證實的(de)有效且無副作用(yòng)治療方法僅有适當的(de)漸進性減肥運動這(zhè)一項。 因此探索新型無毒副作用(yòng)藥物(wù)對(duì)其NASH臨床治療具有重要意義，而可(kě)靠的(de)動物(wù)模型對(duì)探索NASH的(de)發病機制及防治發揮著(zhe)關鍵性作用(yòng)。
目前國内外的(de)NASH模型主要包括3類：
① 營養失調性脂肪肝動物(wù)模型，它包括了(le)高(gāo)脂飲食脂肪肝動物(wù)模型、高(gāo)糖飲食脂肪肝動物(wù)模型和(hé)蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）脂肪肝動物(wù)模型。
② 複合因素誘導的(de)NASH模型，主要是以高(gāo)脂肪飼料加化(huà)學藥物(wù)來(lái)進行造模，包括四氯化(huà)碳脂肪肝動物(wù)模型、四環素脂肪肝動物(wù)模型、乙硫氨酸脂肪肝動物(wù)模型。
③ 特殊品系脂肪肝動物(wù)模型，主要有瘦素缺乏和(hé)抵抗小鼠模型、PTEN基因敲除小鼠模型。其中，MCD飼料誘導的(de)NASH模型是目前國際上被廣泛認可(kě)的(de)模型。
該模型最早由Shinozuka提出，起初是用(yòng)于探討(tǎo)飲食因素對(duì)肝髒腫瘤形成的(de)影(yǐng)響，後來(lái)發現在短期内可(kě)以引起脂肪性肝炎。該模型的(de)脂肪性肝炎發展速度快(kuài)，其病理(lǐ)病變與人(rén)類的(de)NASH類似，因此成爲近年來(lái)國内外學者研究NASH的(de)熱(rè)點模型，但未見關于在大(dà)小鼠體内用(yòng)MCD飼料誘導NASH模型差異比較的(de)報道。
本研究旨在通(tōng)過MCD飼料分(fēn)别建立大(dà)、小鼠NASH模型，比較其生化(huà)和(hé)病理(lǐ)指标，探討(tǎo)兩種動物(wù)模型的(de)差異，爲NASH的(de)基礎研究和(hé)防治藥物(wù)的(de)開發提供可(kě)靠的(de)動物(wù)模型。
實驗動物(wù)與方案
實驗動物(wù)
SPF級C57BL/6雄性小鼠18隻，8~9周齡，體重爲22~25 g；SPF級SD雄性大(dà)鼠18隻，8~9周齡，體重爲300~350g。飼養于遵義醫學院實驗動物(wù)中心，屏障環境動物(wù)房(fáng)室溫（22 ±1）° ，相對(duì)濕度30%~60%，12h光(guāng)照(zhào)/12h黑(hēi)暗，動物(wù)自由采食和(hé)飲水(shuǐ)。
實驗試劑
檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草(cǎo)轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和(hé)膽固醇（TC）含量的(de)試劑盒，均購(gòu)自德國羅氏診斷公司，按說明(míng)書(shū)和(hé)文獻報道的(de)方法進行檢測。
動物(wù)飼料
蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料和(hé)蛋氨酸膽堿充足（MCS）飼料，根據飼料生産公司技術人(rén)員(yuán)的(de)指導進行飼養。
動物(wù)分(fēn)組
将18隻C57BL/6小鼠和(hé)18隻SD大(dà)鼠分(fēn)别随機分(fēn)成正常組（飼喂MCS飼料）和(hé)模型組（飼喂MCD飼料）。模型組需要1周過渡性飼料的(de)喂養，第1 ~3天将MCS和(hé) MCD飼料按2:1混合後喂養，第4 ~5天按1:1混合喂養，第6-7天按1:2混合喂養，1周後完全投喂MCD飼料。過渡性飼養後的(de)第3、5、8周在各組中分(fēn)别随機選取6隻動物(wù)樣本，進行肝功能生化(huà)指标和(hé)肝髒病理(lǐ)的(de)檢測。從過渡飼喂開始且每周稱量動物(wù)體質量（g）并記錄。
實驗結果
體質量變化(huà)
正常對(duì)照(zhào)組實驗動物(wù)的(de)體質量持續增長(cháng)，模型組實驗動物(wù)體質量逐漸減輕；從第 3周開始，相比于正常組，模型組的(de)實驗動物(wù)體質量都顯著降低。
動物(wù)血清中ALT、AST、TC和(hé)TG的(de)含量
從第3周開始，模型組小鼠肝酶AST和(hé)ALT水(shuǐ)平與正常組相比，均已顯著升高(gāo)。相比之下(xià)，大(dà)鼠模型組在檢測的(de)3個(gè)時(shí)間點，肝酶AST水(shuǐ)平無顯著變化(huà)，而ALT水(shuǐ)平從第3周開始顯著升高(gāo)。在檢測的(de)造模後第3周、5周、8 周，大(dà)、小鼠血清中TG和(hé)TC含量均顯著降低。
肝組織HE染色
正常對(duì)照(zhào)組肝小葉結構清晰、完整，肝細胞以中央靜脈爲中心，呈放射狀排 列,無肝細胞氣球樣變或炎症細胞浸潤（見圖1A、C）。MCD飼料飼喂8周後，模型組的(de)大(dà)鼠肝組織小葉結構已被破壞，大(dà)泡性氣球樣變細胞占了(le)總細胞的(de)2/3以上，以肝小葉周邊脂肪變性最爲嚴重， 局部可(kě)見大(dà)泡性氣球樣變和(hé)以單個(gè)核細胞浸潤爲主炎症反應（見圖1B）。8周時(shí)模型組小鼠肝組織光(guāng)鏡下(xià)見肝小葉結構紊亂，細胞出現嚴重的(de)脂肪變 性，中央靜脈周圍出現嚴重、以浸潤爲主的(de)局竈壞 死性炎症（見圖1D）。具體NAFLD活動度積分(fēn)見表3，SD大(dà)鼠和(hé)C57BL/6小鼠綜合評分(fēn)均表現爲模型組與正常組之間差異具有統計學意義（P< 0. 05）。
實驗討(tǎo)論
MCD飼料誘導的(de)NASH模型的(de)主要發病機制是由于飼料缺乏膽堿而引起機體卵磷脂合成不足。蛋氨酸爲合成載脂蛋白所必需的(de)氨基酸，缺乏 酸會導緻低密度脂蛋白膽固醇合成減少，因此無法 将三酰甘油運出肝外而累積形成脂肪肝。另一方面，缺乏膽堿還(hái)會引起肝髒線粒體内部活性氧增加，最終導緻氧應激增加而肝髒發生損傷。氧應激不但導緻細胞多(duō)種功能和(hé)結構損傷，而且活化(huà)TNFα及其他(tā)促炎症細胞因子。
該模型自1978年Shinozuka提出以來(lái)，被國内外的(de)學者廣泛應用(yòng)于藥物(wù)篩選，但是缺少文獻對(duì)該模型在C57BL/6小鼠和(hé)SD大(dà)鼠的(de)系統性報道。于是本實驗飼喂MCD飼料建立大(dà)、小鼠NASH模型，對(duì)其血液的(de)生化(huà)指标和(hé)肝髒的(de)病理(lǐ)指标進行了(le)比較，旨在探討(tǎo)兩種動物(wù)模型的(de)生化(huà)和(hé)病理(lǐ)差異，以選擇理(lǐ)想的(de)動物(wù)模型。
本研究的(de)結果顯示，在肝損傷指數方面，飼喂MCD飼料的(de)第3周開始，模型組小鼠的(de)肝酶AST、 ALT水(shuǐ)平與正常組相比已經顯著升高(gāo)，但模型大(dà)鼠 AST水(shuǐ)平從實驗開始至結束仍無顯著差異，而AST和(hé)ALT的(de)水(shuǐ)平在臨床研究中通(tōng)常作爲肝髒功能評價重要指标，反映脂肪肝的(de)早期損害，因此表明(míng)C57BL/6小鼠對(duì)MCD飼料的(de)反應在早期比SD大(dà)鼠更敏感 ，更容易引起肝損傷肝 。
而且肝組織病理(lǐ)結果顯示，飼喂MCD飼料8周，模型組小鼠肝組織比大(dà)鼠出現的(de)脂肪變性更嚴重，小區(qū)域出現小泡爲主的(de)細胞氣球樣變及輕微的(de)炎症反應；同時(shí)通(tōng)過肝組織病例評分(fēn)結果表明(míng)8周後模型組小鼠肝組織炎症反應及脂肪變性等病理(lǐ)特征的(de)得(de)分(fēn)明(míng)顯高(gāo)于大(dà)鼠。另外，小鼠具有采食量少、成本低及操作方便等優點。因此，綜合生化(huà)指标及病理(lǐ)特征等因素，MCD飼料誘導的(de)C57BL/6小鼠模型比SD大(dà)鼠模型更适用(yòng)于進一步研究NASH.
本文作者：崔國祯/餘漢濠/黃(huáng)天養/王文/徐義祥/程自剛/吳彩燕/李銘源，遵義醫學院
